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Este artigo apresenta a Introdução sequencial de um algoritmo de teste de várias etapas e teste de amplificação de ácido nucleico levando a um aumento na detecção de Clostridioides difficile e uma tendência para o aumento da diversidade de cepas 

Qual o objetivo do estudo?

Estudar o efeito da mudança de estratégias de testagem para detecção de C. difficile e diversidade de cepas.

Qual a justificativa do estudo?

A maioria dos laboratórios de microbiologia clínica substituiu o imunoensaio (Enzyme Immunoassay – EIA) de toxina sozinho por protocolos de teste de várias etapas (Multispet Testing – MST) ou teste de amplificação de ácido nucleico (Nucleic Acid Amplification Test – NAAT) sozinho para a detecção de C. difficile. A adoção destas práticas está amplamente relacionada às características e limitações de cada método de testagem.

O uso de EIA de toxina A e B foi amplamente adotado desde o final da década de 1980 nos Estados Unidos devido a sua rapidez em comparação a outros ensaios de citotoxicidade celular. Contudo, possui uma importante limitação pois há demasiada variabilidade de sensibilidade – 47-83%.

A utilização de MST, que tem como ponto de partida o ensaio de glutamato desidrogenase (GDH) que é presente em cepas toxicogênicas e não-toxicogênicas, mostrou-se como útil para aumentar a sensibilidade. Como o GDH não possui a especificidade apresentada pelo EIA de toxina, este é o segundo passo desse tipo de testagem. Assim, combinando duas técnicas com diferentes características, é possível alcançar maior sensibilidade e especificidade.

Desde 2009 há também a disponibilidade comercial do NAAT. A adoção do NAAT – que ocorreu primeiramente como critério de resolução de discrepância em protocolos de MST e posteriormente sozinho – trouxe a possibilidade de ter especificidade similar a ensaios de citotoxicidade e de cultura citotoxigenicas, e concomitante aumento da sensibilidade.

Qual metodologia foi empregada?

Análise retrospectiva de casos de espécimen de fezes positivos para C. difficile. Foram estudados períodos correspondentes a 6 meses antes e 6 meses depois das mudanças de protocolo; exclusão de um mês considerado como período de adaptação entre cada período.

01/06/2010 – 30/11/2010: EIA de toxina A e B

01/12/2010 – 31/12/2010: Período de adaptação

01/01/2011 – 30/06/2011: MST-A

01/12/2011 – 31/05/2012: MST-B

01/06/2012 – 30/06/2012: Período de adaptação

01/07/2012 – 31/12/2012: NAAT

Cultura:

Amostras positivas – e de suficiente volume e qualidade – foram congelados para testagens subsequentes (-80ºC). Pacientes com episódios recorrentes foram excluídos.

Para testes seguintes as amostras foram descongeladas e a cultura foi realizada em ágar TCCF (Taurocholate-cefoxitin-cycloserine fructose – ágar seletivo para Clostridium difficile) incubado por 48-72 horas em câmara aeróbica. As colônias com morfologia típica de C. difficile foram utilizadas para subcultura em ágar anaeróbico de sangue BBL incubado anaerobicamente por 48-72 horas.

Tipagem por análise de endonuclease de restrição (REA – restriction endonuclease analysis):

Digestão da célula total pela enzima HindIII seguida por separação dos fragmentos por eletroforese. Os padrões de restrição foram comparados com cepas previamente caracterizadas e classificação foi realizada de acordo com a similaridade. Padrões com índice de 90% de compatibilidade foram classificados no mesmo grupo REA (designados por letras); padrões idênticos foram classificados no subgrupo REA específico (designados por números).

Produção quantitativa de toxina in vitro:

Um isolado para cada grupo não-BI e um para cada subgrupo BI foram selecionados em cada período de 6 meses para análise quantitativa da produção de toxina.

As amostras foram incubadas em ágar anaeróbico de sangue BBL por 48h e, em seguida, centrifugadas. Os sobrenadantes foram testados para concentração total de toxina com o uso de kit para toxina A/B. As concentrações foram consideradas como: baixa se <log102.5ng/ml; muito baixa se <log101.1ng/ml.

Quais os principais resultados?

EIA de toxina x MST:

EIA = 79/708 (11%) de positivos no período de junho a novembro de 2010.

MST-A = 121/517 (23%) de positivos no período de janeiro a junho de 2011. 68/121 (56.2%) tiveram EIA positiva e 53 necessitaram de NAAT para resolver a discrepância dos resultados do GDH-EIA.

Foi possível realizar tipagem com REA em 39 das EIA e 65 das MST-A. As amostras de EIA pertenciam a 8 grupos, sendo que 18/39 (46.2%) eram do grupo REA BI; 5 dos 8 grupos eram de baixa produção (média de log102.08ng/ml) e sendo 1 de muito baixa produção. As amostras de MST-A pertenciam a 13 grupos, sendo que 36/65 (55.4%) eram do grupo REA BI; 9 dos 13 grupos eram de baixa produção (média de log101.88ng/ml) e sendo 2 de muito baixa produção.

MST x NAAT sozinho:

MST-B = 80/490 (16%) de positivos no período de dezembro de 2011 a maio de 2012. 34/80 (42.5%) tiveram EIA positiva e 46 necessitaram de NAAT para resolver a discrepância dos resultados do GDH-EIA.

NAAT = 67/368 de positivos no período de julho a dezembro de 2012.

Foi possível realizar tipagem com REA em 49 das MST-B e 39 das NAAT. As amostras de MST-B pertenciam a 13 grupos, sendo que 19/49 (38.8%) eram do grupo REA BI; 12 dos 13 grupos eram de baixa produção (média de log101.20ng/ml) e sendo 6 de muto baixa produção. As amostras de NAAT pertenciam a 10 grupos, sendo que 8/39 (20.5%) eram do grupo REA BI; 9 dos 10 grupos eram de baixa produção (média log101.55ng/ml) e sendo 2 de muito baixa produção.

Comparação epidemiológica:

Primeiros 12 meses (EIA e MST-A) = 51.9% grupo BI, 12.5% grupo 12.5%, 8.7% grupo Y e 0.96% não especifico. Últimos 12 meses (MST-B e NAAT sozinho): 30.7% grupo BI, 1.1% grupo J, 18.2% grupo Y e 9.1% não especifico.

Quais as conclusões e recomendações finais?

MST e NAAT tiveram taxas de detecção semelhantes para C. difficile. Se comparados com o teste EIA, eles apresentaram maior sensibilidade para detecção de cepas e uma tendência a reconhecimento de maior diversidade de cepas – muitas das quais com baixa produção de toxinas.

Que críticas e observações finais?

O estudo traz uma interessante comparação entre diferentes algoritmos de testagem e tipagem de C. difficile e seus resultados. Os abundantes dados são trazidos, além de no texto, em tabelas e figuras extremamente informativas. Os autores foram muito cuidadosos ao elicitar possíveis fatores que podem ter influenciado os resultados; fazem também uma importante reflexão sobre o papel da mudança da distribuição epidemiológica de cepas ao longo do tempo do estudo.

Como destacado na discussão, há ainda investigações a serem feitas a respeito da eficiência desses algoritmos e do valor informativo dos resultados para a identificação de colonização ou infecção por C. difficile. Esse artigo é muito informativo e de significativo impacto cientifico.

Fonte: Skinner AM, et al. (2020). Sequential introduction of a multistep testing algorithm and nucleic acid amplification testing leading to an increase in Clostridioides difficile detection and a trend toward increased strain diversity. Infection Control & Hospital Epidemiology, 41: 1148–1153

Sinopse por: Maria Julia Ricci

Contato: [email protected]



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